Plásmido CRISPR de Activación (h) Pr-Set7: sc-415759-ACT

KMT5A codifica Pr-Set7 (SETD8), una metiltransferasa de lisina que contiene un dominio SET y que cataliza la monometilación de la histona H4 en la lisina 20 (H4K20me1), una marca de cromatina vinculada a la maduración de nucleosomas acoplada a la replicación y a la integridad del genoma. La actividad de Pr-Set7 coordina la progresión del ciclo celular, el licenciamiento de la replicación del ADN y las respuestas al daño del ADN mediante la regulación de la compactación de la cromatina y el reclutamiento de factores de reparación. La expresión o actividad desregulada de KMT5A/Pr-Set7 se ha asociado con estados epigenéticos alterados, estrés replicativo y fenotipos proliferativos descritos en múltiples contextos de cáncer. Como enzima de la cromatina en la intersección entre el control epigenético y la señalización de puntos de control, KMT5A se estudia ampliamente en la regulación transcripcional, la intercomunicación entre vías de reparación del ADN y la dinámica de la cromatina.

Pr-Set7 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KMT5A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pr-Set7 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KMT5A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KMT5A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pr-Set7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KMT5A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pr-Set7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pr-Set7 en células tumorales con expresión de KMT5A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.