Plásmido CRISPR de Activación (h) PPP1R3: sc-405135-ACT

PPP1R3A codifica PPP1R3, una subunidad reguladora de la fosfatasa de proteínas 1 (PP1) dirigida al glucógeno, que ayuda a localizar la PP1 catalítica en las partículas de glucógeno y a coordinar la desfosforilación de enzimas metabólicas clave. Al modular la actividad de la glucógeno sintasa y de la fosforilasa, PPP1R3A contribuye a la dinámica de almacenamiento de glucosa e integra la señalización sensible a la insulina con el metabolismo de los carbohidratos en el músculo esquelético y otros tejidos sensibles a la insulina. La expresión o regulación alteradas de PPP1R3A se han relacionado con un manejo desregulado del glucógeno y con fenotipos metabólicos, lo que la hace relevante para estudios de señalización de la insulina, homeostasis energética y adaptación metabólica específica de tejido. Como regulador de PP1 con función tipo andamio, PPP1R3A también constituye un nodo manejable para analizar los mecanismos de direccionamiento de fosfatasas dentro de redes más amplias de fosforilación.

PPP1R3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP1R3A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PPP1R3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP1R3A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP1R3A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PPP1R3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP1R3A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PPP1R3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PPP1R3 en células tumorales con expresión de PPP1R3A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.