Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP5: sc-405979-ACT

PPP5C code pour la phosphatase sérine/thréonine 5 (PP5), une phosphatase à domaine TPR qui intègre des signaux grâce à son association avec les complexes chaperons HSP90 et de nombreuses protéines clientes. PP5 régule le contrôle, dépendant de la phosphorylation, des réponses au stress, de la progression du cycle cellulaire et de la signalisation des dommages à l’ADN, notamment via la modulation de voies liées à la signalisation ATM/ATR et aux réseaux MAPK. En déphosphorylant des régulateurs clés, PPP5C influence la fonction du récepteur des glucocorticoïdes, le contrôle des points de contrôle (checkpoints) et la protéostase, ce qui en fait un nœud pertinent pour étudier la fidélité de la transduction du signal. Une activité ou une expression dérégulée de PPP5C a été associée à des phénotypes de prolifération et de tolérance au stress altérés, rapportés dans des contextes relevant de la cancérologie et des neurosciences, ce qui soutient sa pertinence dans des modèles mécanistiques de maladie.

PP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP5C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP5C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP5C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP5C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP5 dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP5C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.