Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2A-B56-γ: sc-402726-ACT

PPP2R5C code la sous-unité régulatrice B56γ de la protéine phosphatase 2A (PP2A), une phosphatase sérine/thréonine majeure qui oriente l’activité catalytique vers des substrats et des localisations subcellulaires spécifiques. PP2A‑B56γ contribue au contrôle de la progression du cycle cellulaire, de la signalisation des dommages à l’ADN, de la fidélité du point de contrôle mitotique et de la transduction du signal via des voies telles que PI3K–AKT, MAPK et Wnt/β-caténine, en coordonnant la déphosphorylation de régulateurs clés. Une expression modifiée de PPP2R5C ou une altération de la composition de l’holoenzyme PP2A peut remodeler les réseaux de phosphorylation qui influencent la prolifération, la stabilité du génome et les réponses au stress. Ces propriétés font de PP2A‑B56γ un nœud utile pour étudier l’isolation des voies guidée par les phosphatases et les mécanismes reliant une déphosphorylation dérégulée à des phénotypes associés aux maladies.

PP2A-B56-γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP2R5C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2A-B56-γ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP2R5C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP2R5C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2A-B56-γ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP2R5C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2A-B56-γ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2A-B56-γ dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP2R5C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.