PORCN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-413044-ACT

Das humane PORCN-Gen kodiert eine membrangebundene O-Acyltransferase im endoplasmatischen Retikulum, die die Palmitoleoylierung von WNT-Liganden katalysiert – eine Modifikation, die für die WNT-Sekretion, die Bildung extrazellulärer Gradienten und die Rezeptorbindung erforderlich ist. Über diesen essenziellen Verarbeitungsschritt reguliert PORCN die kanonische und nicht-kanonische WNT-Signalübertragung und beeinflusst dadurch die β‑Catenin-abhängige Transkription, Zellschicksalsfestlegung, Proliferation und Gewebemusterbildung. Eine veränderte, PORCN-abhängige WNT-Aktivität wird mit Entwicklungsanomalien und Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch eine fehlregulierte WNT-Signalwegaktivität gekennzeichnet sind, was den Einsatz von PORCN in mechanistischen Studien zu Differenzierungsprogrammen und zur Umverdrahtung von Signalnetzwerken unterstützt. Die PORCN-Funktion ist zudem relevant für Untersuchungen zur epithelialen Homöostase, zur Stammzellbiologie sowie zu Signalweg-Crosstalk, der Morphogenese und onkogene Signalzustände beeinflusst.

PORCN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PORCN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PORCN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PORCN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PORCN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PORCN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PORCN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PORCN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PORCN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PORCN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.