Pol III RPC32 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417072-ACT

POLR3G kodiert die Pol-III-Untereinheit RPC32, eine zentrale Komponente der RNA-Polymerase III, die für die Transkription kleiner nichtkodierender RNAs erforderlich ist, darunter tRNAs und 5S-rRNA, die die Ribosomenbiogenese und Proteostase unterstützen. Über ihre Rolle bei der Assemblierung von Pol III und der promotorabhängigen Initiation trägt Pol-III-RPC32 zu zellulären Wachstumsprogrammen und zur metabolischen Anpassung bei, die mit Nährstoffsensorik und Stressantworten verknüpft sind. Eine veränderte Regulation der Pol-III-Transkriptionsleistung und ihrer akzessorischen Untereinheiten wurde mit fehlregulierter Proliferation sowie Signalwegen der angeborenen Immunantwort in Verbindung gebracht, wodurch POLR3G ein nützliches Ziel für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle kleiner RNA-Netzwerke darstellt. Die Untersuchung der POLR3G-Funktion kann helfen zu klären, wie die Pol-III-Aktivität in krankheitsrelevanten zellulären Zuständen mit der Chromatinregulation und der RNA-Homöostase zusammenwirkt.

Pol III RPC32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLR3G-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pol III RPC32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLR3G-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLR3G-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pol III RPC32-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLR3G-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pol III RPC32-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pol III RPC32-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLR3G-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.