POL H Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401794-ACT

POLH codifica a DNA polimerase eta (Pol η), uma polimerase especializada da família Y que realiza síntese de DNA por translesão para contornar dímeros de pirimidina ciclobutano induzidos por UV e outros adutos volumosos no DNA durante a fase S. Ao estender forquilhas de replicação bloqueadas, POLH ajuda a manter a estabilidade do genoma e atua em coordenação com a resposta a danos no DNA, o reparo por excisão de nucleotídeos e as vias de reparo pós-replicação. Defeitos em POLH comprometem a fidelidade do bypass de lesões e aumentam a carga mutacional, associando sua disfunção a fenótipos de sensibilidade à radiação UV e predisposição ao câncer, incluindo o xeroderma pigmentoso variante. Por isso, POLH é amplamente estudado na biologia do estresse replicativo, nos mecanismos de mutagênese e nas interações entre vias que governam a escolha de reparo do DNA.

POL H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

POL H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de POL H. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de POL H no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via POL H em células tumorais com expressão de POLH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.