PNK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404266-ACT

Humanes PNKP kodiert die Polynukleotidkinase 3′-Phosphatase (PNK), ein bifunktionales Enzym zur Verarbeitung von DNA-Enden, das die für die Ligation bei der Reparatur von DNA-Einzelstrangbrüchen erforderlichen 5′-Phosphat- und 3′-Hydroxyl-Enden wiederherstellt. PNK wirkt nachgeschaltet von PARP1 und XRCC1 und ist sowohl mit der Basenexzisionsreparatur als auch mit dem nicht-homologen End-Joining verknüpft, indem es geschädigte DNA-Enden aufbereitet, die durch reaktive Sauerstoffspezies, ionisierende Strahlung und abortive Topoisomerase-Reaktionen entstehen. Über diese Signal- und Reparaturwege trägt PNKP zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität bei und unterstützt eine normale Replikation und Transkription in proliferierenden und postmitotischen Zellen. Störungen der PNKP-vermittelten Endverarbeitung sind mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress verbunden und wurden mit neuroentwicklungsbedingten und neurodegenerativen Phänotypen in Zusammenhang gebracht, die aus einer beeinträchtigten DNA-Reparaturkapazität resultieren.

PNK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PNKP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PNK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PNKP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PNKP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PNK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PNKP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PNK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PNK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PNKP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.