PLU-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403771-ACT

KDM5B codifica a PLU-1 (JARID1B), uma desmetilase de lisina de histonas contendo o domínio Jumonji C (JmjC) que remove preferencialmente as marcas H3K4me3/2, remodelando assim a cromatina associada a promotores e os programas transcricionais. Por meio de interações com fatores de transcrição específicos de linhagem e complexos de remodelamento de cromatina, a PLU-1 contribui para a regulação da progressão do ciclo celular, dos estados de diferenciação e da manutenção da cromatina ligada à replicação. Alterações na atividade de KDM5B têm sido associadas à plasticidade epigenética e à reprogramação transcricional em múltiplos contextos tumorais, tornando-o um alvo amplamente utilizado para estudar o controle dependente de cromatina da proliferação e da identidade celular. Em modelos celulares humanos, a perturbação de PLU-1 ajuda a dissecar vias que conectam a dinâmica de metilação de histonas aos resultados de expressão gênica e às transições fenotípicas.

PLU-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KDM5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PLU-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KDM5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KDM5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PLU-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KDM5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PLU-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PLU-1 em células tumorais com expressão de KDM5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.