Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLC ζ: sc-403348-ACT

Le gène humain **PLCZ1** code la phospholipase C zêta (PLC ζ), une phospholipase des phosphoinositides spécifique des spermatozoïdes qui déclenche des oscillations de Ca2+ après la fusion des gamètes en hydrolysant le PIP2 pour générer l’IP3 et le DAG. Ce programme de signalisation calcique pilote l’activation de l’ovocyte et les événements précoces du développement embryonnaire, faisant de PLC ζ un régulateur clé de la transduction des signaux associée à la fécondation. Une expression ou une fonction dérégulée de PLCZ1 a été associée à une activation anormale de l’ovocyte et à certaines formes d’infertilité masculine, ce qui en fait une cible pertinente pour les études en biologie de la reproduction et en signalisation du développement. En tant qu’isoforme de PLC hautement spécialisée, PLC ζ sert également de modèle pour disséquer l’activité des PLC indépendante d’un stimulus, la rétroaction dépendante du Ca2+ et les voies médiées par le récepteur de l’IP3.

PLC ζ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLCZ1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLC ζ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLCZ1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLCZ1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLC ζ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLCZ1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLC ζ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLC ζ dans les cellules tumorales présentant une expression de PLCZ1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.