Plásmido CRISPR de Activación (h) plakophilin 2: sc-402990-ACT

PKP2 codifica la plakofilina 2, una proteína con repeticiones armadillo que se localiza en los desmosomas y en los discos intercalares, donde estabiliza la adhesión célula–célula al conectar las cadherinas desmosómicas con las redes del citoesqueleto. Mediante interacciones con desmoplaquina, plakoglobina y filamentos intermedios, la plakofilina 2 contribuye a la integridad de las uniones, la mecanotransducción y la arquitectura tisular, en particular en epitelios sometidos a estrés mecánico y en miocitos cardíacos. La función de PKP2 también se integra con programas de señalización que responden al estado de adhesión celular y a la tensión del citoesqueleto. Las alteraciones genéticas y funcionales en PKP2 se han asociado con fenotipos de miocardiopatía arritmogénica y con defectos relacionados en la conducción miocárdica y la remodelación estructural, lo que respalda su utilidad como diana en estudios de biología de las uniones cardíacas.

plakophilin 2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PKP2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

plakophilin 2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PKP2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PKP2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de plakophilin 2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PKP2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de plakophilin 2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía plakophilin 2 en células tumorales con expresión de PKP2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.