PKR1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409799-ACT

PROKR1 kodiert den Prokinetikin-Rezeptor 1 (PKR1), einen G‑Protein-gekoppelten Rezeptor der Klasse A, der Prokinetikine bindet und dadurch die Mobilisierung von Calcium, die MAPK/ERK-Signalübertragung sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme reguliert, welche Chemotaxis, angiogene Antworten und die Kontraktilität glatter Muskulatur steuern. In menschlichen Geweben prägt die PKR1-Signalisierung über Gαq und verwandte Signalwege die Rekrutierung von Entzündungszellen sowie die Gefäß- und Reproduktionsphysiologie. Eine veränderte PROKR1-Aktivität wurde mit einer fehlregulierten Entzündungssignalgebung und Prozessen des vaskulären Remodelings in Verbindung gebracht und wird im Kontext der gastrointestinalen Motilität, der Schmerzsignalübertragung und von Reproduktionsstörungen untersucht. Als Zelloberflächenrezeptor stellt PKR1 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt dar, um ligandengetriebene GPCR-Signalgebung und Pathway-Crosstalk in relevanten primären und gentechnisch veränderten Zellmodellen zu analysieren.

PKR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PROKR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKR1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PROKR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PROKR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKR1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PROKR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKR1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKR1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PROKR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.