Plásmido CRISPR de Activación (m) PKC lambda/iota: sc-422263-ACT

Prkci codifica la isoforma atípica de la proteína quinasa C, PKC lambda/iota, una quinasa de serina/treonina que actúa como componente central del complejo de polaridad PAR y regula la polaridad apical–basal, la división celular asimétrica y la organización de las uniones estrechas. En células de ratón, PKC lambda/iota integra señales upstream procedentes de pequeñas GTPasas y de la señalización por fosfoinosítidos para coordinar la dinámica del citoesqueleto, el tráfico vesicular y la migración direccional. Modula señales de proliferación y supervivencia mediante vías que convergen con los outputs transcripcionales de PI3K–AKT, NF-κB y Hippo/YAP, influyendo en la diferenciación y la arquitectura tisular. La desregulación de la actividad de las PKC atípicas se ha asociado con alteraciones de la integridad epitelial, un control del crecimiento aberrante y fenotipos vinculados a la inflamación, lo que convierte a Prkci en un nodo útil para estudios mecanísticos en modelos de desarrollo, regeneración y enfermedad.

PKC lambda/iota El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Prkci sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PKC lambda/iota El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Prkci en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Prkci, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PKC lambda/iota. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Prkci y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PKC lambda/iota en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PKC lambda/iota en células tumorales con expresión de Prkci silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.