Plásmido CRISPR de Activación (h) PKAγ cat: sc-400874-ACT

PRKACG codifica la subunidad catalítica gamma de la proteína quinasa A (PKA) dependiente de AMPc, un efector central de la señalización GPCR–adenilato ciclasa que fosforila diversos sustratos para regular el metabolismo, la dinámica del citoesqueleto, la actividad de canales iónicos y programas transcripcionales como la expresión génica dependiente de CREB. A través de la señalización AMPc/PKA, PRKACG participa en la integración de señales entre vías que incluyen MAPK, respuestas dependientes de calcio y la regulación del ciclo celular y la diferenciación. La actividad desregulada de PKA y las alteraciones en la señalización por AMPc se han implicado en la señalización oncogénica, disfunciones endocrinas y metabólicas, y trastornos de la excitabilidad neuronal y cardíaca, lo que convierte a PRKACG en un nodo útil para estudios mecanísticos del reconfiguramiento de vías.

PKAγ cat El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKACG sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PKAγ cat El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKACG en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKACG, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PKAγ cat. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKACG y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PKAγ cat en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PKAγ cat en células tumorales con expresión de PRKACG silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.