PIWIL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402211-ACT

PIWIL2 (HIWI2) kodiert ein Argonaute-Protein der PIWI-Unterfamilie, das piRNAs bindet und zur durch kleine RNAs gesteuerten Stilllegung transponierbarer Elemente beiträgt, wodurch die Genomintegrität in Keimbahn- und keimbahnähnlichen Kontexten unterstützt wird. Durch seine Beteiligung an der piRNA-Biogenese und epigenetischen Regulation beeinflusst PIWIL2 den Chromatinzustand, DNA-Methylierungsmuster sowie die posttranskriptionelle Kontrolle von Ziel-RNAs. Eine aberrante PIWIL2-Expression wurde in mehreren Krebsarten beschrieben und wird häufig im Zusammenhang mit tumorassoziierten stammzellähnlichen Phänotypen, Proliferationsprogrammen und resistenzassoziierten Signalnetzwerken untersucht. Diese Eigenschaften machen PIWIL2 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um RNA-vermittelte Genregulation und Mechanismen der Genomabwehr in menschlichen Zellen zu analysieren.

PIWIL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIWIL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIWIL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIWIL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIWIL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIWIL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIWIL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIWIL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIWIL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIWIL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.