Plásmido CRISPR de Activación (h) PIP5KIII: sc-402813-ACT

PIKFYVE codifica la fosfatidilinositol-3-fosfato 5-quinasa tipo III (PIP5KIII), una quinasa de lípidos que genera PI(3,5)P2 y contribuye a la identidad de la membrana endolisosomal, el tráfico vesicular y la homeostasis de los lisosomas. PIP5KIII actúa dentro del complejo PIKFYVE–VAC14–FIG4 para regular la maduración de endosomas, el flujo autofágico y la señalización sensible a nutrientes, conectando el metabolismo de los fosfoinosítidos con la adaptación celular al estrés. La alteración de esta vía modifica la dinámica de vacuolas/lisosomas y se asocia con fenotipos neurodegenerativos y neuromusculares, lo que convierte a PIKFYVE en un nodo clave para estudiar defectos del tráfico de membranas. La regulación de PIKFYVE en humanos también es relevante para investigaciones sobre la entrada de patógenos, el recambio de receptores y la señalización metabólica que dependen de la clasificación endosomal.

PIP5KIII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PIKFYVE sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PIP5KIII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PIKFYVE en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PIKFYVE, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PIP5KIII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PIKFYVE y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PIP5KIII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PIP5KIII en células tumorales con expresión de PIKFYVE silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.