Plásmido CRISPR de Activación (h) pHyde: sc-405526-ACT

STEAP3 (pHyde) codifica un miembro de la familia de antígenos epiteliales de próstata con seis dominios transmembrana que funciona como ferrirreductasa, catalizando la reducción de Fe³⁺ a Fe²⁺ para favorecer la captación y el uso celular del hierro. Está enriquecida en compartimentos endosomales y se integra con el tráfico de transferrina, la homeostasis del hierro y el equilibrio redox, influyendo así en el metabolismo mitocondrial y en el manejo de especies reactivas de oxígeno. La actividad desregulada de STEAP3 se ha vinculado con alteraciones en el manejo del hierro y con programas de estrés oxidativo observados en múltiples contextos de enfermedad, incluida la biología de neoplasias hematológicas y de tumores sólidos. Como regulador del metabolismo del hierro en humanos, STEAP3 se estudia con frecuencia en vías que gobiernan la susceptibilidad a la ferroptosis, la señalización inflamatoria y la adaptación metabólica bajo estrés.

pHyde El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de STEAP3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

pHyde El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus STEAP3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional STEAP3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de pHyde. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo STEAP3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de pHyde en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía pHyde en células tumorales con expresión de STEAP3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.