Plásmido CRISPR de Activación (h) PH-4: sc-409966-ACT

El gen humano P4HTM codifica PH-4, una prolil 4-hidroxilasa asociada al retículo endoplásmico que cataliza la hidroxilación de residuos de prolina en proteínas sustrato, una modificación postraduccional que puede influir en el plegamiento, la estabilidad y la secreción de las proteínas. Como parte de la red más amplia de prolil hidroxilasas, PH-4 vincula la actividad enzimática dependiente de oxígeno y metabolitos con la proteostasis y las vías de adaptación celular. La desregulación de la química de hidroxilación y del procesamiento en el RE se ha asociado con señales de estrés alteradas y fenotipos metabólicos, lo que sustenta el interés en P4HTM como un nodo que conecta el estado redox, el control de calidad proteica y la regulación del estado celular. Las variaciones genéticas y los cambios de expresión en P4HTM se han investigado en contextos relacionados con rasgos metabólicos y del neurodesarrollo, lo que motiva estudios mecanísticos en modelos celulares humanos relevantes.

PH-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de P4HTM sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PH-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus P4HTM en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional P4HTM, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PH-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo P4HTM y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PH-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PH-4 en células tumorales con expresión de P4HTM silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.