Peroxin 14 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405075-ACT

PEX14 codifica a peroxina 14, um componente essencial da maquinaria de importação peroxissomal que ancora os complexos recetores PEX5/PEX7 na membrana do peroxissoma, permitindo a translocação de enzimas da matriz. Por meio do seu papel na biogénese do peroxissoma e na importação de proteínas, a PEX14 sustenta a β-oxidação de ácidos gordos, a síntese de lípidos éter e a desintoxicação de espécies reativas de oxigénio, relacionando-a com o equilíbrio redox celular e a homeostase lipídica. Alterações na importação e na biogénese peroxissomais estão associadas a distúrbios de biogénese do peroxissoma e a fenótipos metabólicos e do neurodesenvolvimento mais amplos, tornando a regulação de PEX14 relevante para estudos mecanísticos da disfunção de organelos. Em modelos celulares humanos, a modulação de PEX14 oferece um ponto de entrada viável para investigar vias dependentes do peroxissoma e a sua interação com a sinalização mitocondrial e inflamatória.

Peroxin 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PEX14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Peroxin 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PEX14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PEX14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Peroxin 14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PEX14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Peroxin 14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Peroxin 14 em células tumorais com expressão de PEX14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.