PBK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404069-ACT

A quinase de ligação a PDZ (PBK/TOPK) é uma quinase de serina/treonina enriquecida em tecidos proliferativos e frequentemente elevada em células transformadas, onde sustenta a progressão mitótica e a manutenção do genoma. A PBK atua no controlo do ciclo celular ao coordenar a transição G2/M e a dinâmica dos centrossomas/fuso, e pode modular a sinalização MAPK para influenciar respostas ao stress e programas de proliferação. Por meio da fosforilação de substratos envolvidos na regulação da cromatina e no controlo de checkpoints, a PBK contribui para a tolerância a danos no DNA e para a aptidão replicativa. A expressão desregulada de PBK tem sido associada à biologia tumoral, tornando-a um alvo útil para estudar sinalização oncogénica, dependência do ciclo celular e estados transcricionais ligados à proliferação.

PBK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PBK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PBK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PBK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PBK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PBK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PBK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PBK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PBK em células tumorais com expressão de PBK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.