Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pax-7: sc-400662-ACT

PAX7 code le facteur de transcription à domaine paired box Pax-7, un régulateur clé de la spécification de la lignée myogénique et du maintien des cellules souches du muscle squelettique. Pax-7 coordonne des programmes transcriptionnels contrôlant la prolifération, l’auto-renouvellement et la différenciation, en agissant de concert avec les facteurs régulateurs myogéniques pour gouverner la régénération musculaire et la mise en place des patrons développementaux. Outre ses rôles dans le système nerveux central et dans les lignées dérivées de la crête neurale, une activité dérégulée de PAX7 a été associée à une altération de l’identité cellulaire et à des états transcriptionnels oncogéniques, notamment dans le rhabdomyosarcome induit par des fusions. En tant que déterminant de lignée, Pax-7 est largement utilisé comme marqueur et nœud fonctionnel pour étudier les décisions de destinée, la régulation de la chromatine et les réseaux de gènes du développement dans les cellules humaines.

Pax-7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAX7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pax-7 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAX7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAX7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pax-7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAX7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pax-7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pax-7 dans les cellules tumorales présentant une expression de PAX7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.