Plasmide CRISPR d'Activation (m) Pax-6: sc-422119-ACT

Le gène murin *Pax6* code le facteur de transcription Pax-6, un régulateur de liaison à l’ADN de type paired box/homeobox qui orchestre des programmes d’expression génique nécessaires au développement de l’œil, du télencéphale (forebrain) et du compartiment endocrinien du pancréas. Pax-6 s’intègre à des réseaux de signalisation du développement, notamment Wnt, Shh, BMP/TGF-β et Notch, afin de contrôler la spécification des progéniteurs, l’engagement de lignée et la différenciation neuronale. Une modification de la dose de Pax6 ou de son activité régulatrice perturbe l’organisation du développement et a été associée, dans des systèmes modèles, à des malformations oculaires congénitales, des anomalies neurodéveloppementales et des dysfonctionnements endocriniens. En tant que régulateur maître, Pax-6 est fréquemment utilisé pour étudier la logique cis-régulatrice, les transitions d’état de la chromatine et les circuits transcriptionnels à l’origine des décisions de destinée cellulaire.

Pax-6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pax6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pax-6 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pax6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pax6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pax-6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pax6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pax-6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pax-6 dans les cellules tumorales présentant une expression de Pax6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.