PASK CRISPR Activation Plasmid (m): sc-435323-ACT

Mouse Pask kodiert die PAS-Domänen-haltige Serin/Threonin-Proteinkinase (PASK), einen metabolischen Sensor, der Nährstoff- und Energiesignale mit transkriptioneller sowie posttranslationaler Regulation verknüpft. PASK ist an Signalnetzwerken beteiligt, die mit der Glukosehomöostase, der Mitochondrienfunktion und der Regulation der Proteinsynthese zusammenhängen, und es wurden Verbindungen zu mTOR-assoziierten Prozessen sowie zur stressresponsiven Anpassung beschrieben. In unterschiedlichen Zelltypen kann die PASK-Aktivität Proliferations- und Differenzierungsprogramme beeinflussen, indem sie die Phosphorylierung nachgeschalteter Effektoren und transkriptionelle Outputs moduliert. Eine fehlregulierte PASK-Signalisierung wurde mit metabolischen und endokrinen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch sie für mechanistische Untersuchungen der Insulinsignalisierung, des Lipidstoffwechsels und der zellulären Energiebilanz relevant ist.

PASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pask-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pask-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pask-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PASK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pask-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PASK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PASK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pask-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.