Plasmide CRISPR d'Activation (h) Parkin: sc-400226-ACT

Le gène humain **PARK2** code la protéine Parkin, une ubiquitine‑ligase E3 de type RBR qui marque les protéines et organites endommagés afin qu’ils soient éliminés par le protéasome dépendant de l’ubiquitine et par l’autophagie. Parkin est un effecteur central de la mitophagie **PINK1–Parkin** : il régule le contrôle qualité mitochondrial, les réponses au stress oxydant et l’homéostasie énergétique via l’ubiquitination coordonnée de substrats de la membrane externe mitochondriale. En modulant le renouvellement des protéines et la dynamique des organites, Parkin influence le maintien des neurones et, plus largement, les programmes d’adaptation cellulaire au stress. Un dérèglement de l’ubiquitination et de la mitophagie liées à **PARK2** a été associé à la neurodégénérescence et à une signalisation mitochondriale altérée, ce qui explique son usage fréquent dans les études mécanistiques des dysfonctionnements mitochondriaux.

Parkin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PARK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Parkin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PARK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PARK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Parkin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PARK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Parkin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Parkin dans les cellules tumorales présentant une expression de PARK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.