PARD6A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401184-ACT

PARD6A kodiert „partitioning defective 6 homolog alpha“, eine zentrale Komponente des PAR-Polarisierungskomplexes, der mit PAR3 und atypischer PKC zusammenwirkt, um die apikobasale Polarität aufzubauen und die asymmetrische Zellteilung zu regulieren. Durch die Koordination der Tight-Junction-Assemblierung, der Zytoskelettorganisation und des Vesikeltransports beeinflusst PARD6A die epitheliale Morphogenese, die Zellmigration sowie die Aufrechterhaltung der differenzierten Gewebearchitektur. Störungen der Signalübertragung des PAR-Komplexes werden mit beeinträchtigter Integrität der Zell-Zell-Kontakte und veränderten Proliferationsprogrammen in Verbindung gebracht – Prozesse, die häufig mit Tumorentstehung und metastatischer Progression assoziiert sind. PARD6A wird daher breit in Modellen zum Verlust epithelialer Polarität, zur Invasion und zum Signalkreuzgespräch untersucht, insbesondere im Zusammenhang mit kleinen GTPasen und Kinasewegen, die die Zellarchitektur steuern.

PARD6A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PARD6A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PARD6A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PARD6A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PARD6A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PARD6A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PARD6A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PARD6A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PARD6A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PARD6A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.