PARD3B CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-406097-ACT-2

Das menschliche Gen PARD3B kodiert Partitioning Defective 3 Homolog B, ein Polaritäts‑Gerüstprotein, das an Zell‑Zell‑Kontakten lokalisiert und zusammen mit Partnern wie atypischer PKC und anderen PAR‑Proteinen den Aufbau apikal‑basaler Polaritätskomplexe koordiniert. Über PDZ‑Domänen‑vermittelte Interaktionen trägt PARD3B zur Regulation der Tight‑Junction‑Organisation, der epithelialen Morphogenese und der gerichteten Migration bei, indem es Signale aus Zytoskelett‑ und Small‑GTPase‑Signalwegen integriert. Eine veränderte Funktion des Polaritätsnetzwerks und der junctionalen Integrität unter Beteiligung von PARD3B wurde mit Prozessen in Verbindung gebracht, die für Tumorprogression, Invasion und eine gestörte epitheliale Barrierefunktion relevant sind. Geneditierung von PARD3B ermöglicht mechanistische Untersuchungen polaritätsabhängiger Signalübertragung, der Junction‑Dynamik und von Zellzustandsübergängen in menschlichen Zellmodellen mittels Knockout, Knock‑in oder domänenspezifischer Perturbationen.

PARD3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PARD3B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PARD3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PARD3B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PARD3B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PARD3B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PARD3B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PARD3B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PARD3B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PARD3B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.