PAR-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400333-ACT

F2RL1 kodiert den proteaseaktivierten Rezeptor 2 (PAR-2), einen G‑Protein-gekoppelten Rezeptor, der durch Spaltung durch Serinproteasen aktiviert wird. Dabei wird ein „tethered ligand“ (gebundener Ligand) freigelegt, der die intrazelluläre Signalübertragung auslöst. PAR-2 koppelt an Gαq/11, Gαi/o und Gα12/13 und reguliert so Phospholipase‑C‑vermittelten Ca2+-Flux, RhoA-abhängige Zytoskelett-Umgestaltung, MAPK/ERK-Kaskaden sowie NF‑κB‑getriebene Transkription und prägt damit Entzündungs- und Barriereantworten. Dieser Rezeptor ist breit in epithelialen und endothelialen Kompartimenten sowie in Immunzellen exprimiert und verknüpft extrazelluläre Proteaseaktivität mit Zytokinfreisetzung, Leukozytenrekrutierung und nozizeptiver Signalgebung. Eine fehlregulierte PAR-2-Signalgebung wird mit chronischer Entzündung, Fibrose, bronchialer Hyperreagibilität, Pruritus und dem Remodelling des tumorassoziierten Mikromilieus in Verbindung gebracht und stellt damit ein nützliches Ziel für mechanistische Untersuchungen proteasegetriebener Signalwege dar.

PAR-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen F2RL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PAR-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des F2RL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der F2RL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PAR-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native F2RL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PAR-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PAR-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem F2RL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.