Plásmido CRISPR de Activación (h2) PACE4: sc-405605-ACT-2

El PCSK6 humano codifica la convertasa de proproteínas PACE4, una serina endoproteasa secretada y asociada a la matriz extracelular que activa diversos precursores proteicos al escindir residuos básicos apareados dentro de la vía secretora y en la superficie celular. PACE4 contribuye a la proteostasis y a la señalización intercelular al procesar factores de crecimiento, receptores, metaloproteinasas y componentes de la matriz extracelular, influyendo así en rutas vinculadas al desarrollo, la remodelación tisular y la migración celular. La actividad desregulada de PCSK6/PACE4 se ha asociado con redes proteolíticas alteradas en la progresión del cáncer, rasgos cardiovasculares y contextos de remodelación inflamatoria o fibrótica. Las herramientas de edición génica y de perturbación funcional de PCSK6 permiten estudios mecanísticos de la maduración de sustratos dependiente de convertasas, el perfilado del secretoma y el análisis de circuitos de señalización regulados por proteasas en modelos celulares humanos.

PACE4 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PCSK6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PACE4 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PCSK6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PCSK6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PACE4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PCSK6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PACE4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PACE4 en células tumorales con expresión de PCSK6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.