Plásmido CRISPR de Activación (h) P5CR: sc-410971-ACT

El gen humano **PYCR1** codifica la **reductasa 1 de pirrolina-5-carboxilato** (P5CR), una enzima mitocondrial que cataliza la reducción dependiente de **NAD(P)H** de la pirrolina-5-carboxilato a prolina en el paso final de la biosíntesis de prolina. Mediante su acoplamiento al metabolismo del glutamato y la ornitina, PYCR1 contribuye a la homeostasis redox, a la disponibilidad de aminoácidos y a la función mitocondrial, con efectos posteriores sobre la proteostasis y la biología de la matriz extracelular. La alteración de la actividad de PYCR1 se ha asociado con fenotipos del tejido conectivo y respuestas al estrés metabólico, y la desregulación del metabolismo de la prolina se examina con frecuencia en contextos como la señalización por estrés oxidativo, microambientes ricos en colágeno y el remodelado proliferativo. Estas características hacen de PYCR1 un nodo útil para investigar cómo el metabolismo mitocondrial y el equilibrio redox moldean el estado celular y la adaptación al estrés.

P5CR El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PYCR1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

P5CR El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PYCR1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PYCR1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de P5CR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PYCR1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de P5CR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía P5CR en células tumorales con expresión de PYCR1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.