Plásmido CRISPR de Activación (h) p40-phox: sc-401461-ACT

NCF4 codifica p40-phox, un componente regulador del complejo NADPH oxidasa de los fagocitos (NOX2) que modula el ensamblaje y la actividad de la oxidasa en endomembranas y fagosomas. A través de interacciones con p67-phox (NCF2), p47-phox (NCF1) y el citocromo de membrana b558, p40-phox ayuda a controlar la generación dependiente de estímulos de especies reactivas de oxígeno, lo que favorece la eliminación microbiana y la señalización redox. Esta vía se integra con procesos de la inmunidad innata, como la fagocitosis, la señalización del inflamasoma y las respuestas de citocinas, donde una regulación alterada de la oxidasa puede perturbar la defensa del hospedador y la homeostasis inflamatoria. La actividad desregulada de NOX2 y la señalización dependiente de p40-phox se han vinculado a fenotipos de inmunodeficiencia e inflamación, lo que proporciona un punto de entrada mecanístico para estudiar la regulación del estallido oxidativo en células mieloides.

p40-phox El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NCF4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

p40-phox El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NCF4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NCF4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de p40-phox. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NCF4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de p40-phox en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía p40-phox en células tumorales con expresión de NCF4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.