Plasmide CRISPR d'Activation (h) P2P-R: sc-404165-ACT

Le gène humain RBBP6 code la protéine P2P-R, un facteur multidomaine qui s’associe à p53 et à des composants de la voie du rétinoblastome afin d’influencer la progression du cycle cellulaire, l’apoptose et le contrôle transcriptionnel. RBBP6 comporte des motifs compatibles avec des rôles dans la régulation des protéines dépendante de l’ubiquitine et dans le traitement de l’ARN, ce qui le relie à la protéostase et aux programmes de maturation des ARNm qui coordonnent la prolifération. Une activité altérée de RBBP6 a été rapportée dans divers contextes de biologie tumorale, où les perturbations de la signalisation p53/RB et du contrôle des points de contrôle sont fréquentes, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des réponses au stress oncogénique. Dans des modèles cellulaires, la modulation des niveaux de P2P-R peut servir à analyser le dialogue entre les voies de signalisation des dommages à l’ADN, la régulation transcriptionnelle et le métabolisme post-transcriptionnel des ARN.

P2P-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBBP6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P2P-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBBP6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBBP6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P2P-R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBBP6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P2P-R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P2P-R dans les cellules tumorales présentant une expression de RBBP6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.