p19 INK4D/CDKN2D Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401761-ACT

CDKN2D codifica a p19 INK4D, um membro da família INK4 de inibidores de quinases dependentes de ciclina que restringe seletivamente a atividade de CDK4 e CDK6 para impor o checkpoint G1/S. Ao limitar a fosforilação das proteínas RB e modular programas transcricionais dirigidos por E2F, a p19 INK4D contribui para a proliferação controlada, a diferenciação e a senescência celular. O CDKN2D integra redes de ciclo celular e de resposta ao estresse, com relevância funcional em contextos de sinalização oncogênica nos quais a integridade do eixo CDK4/6–RB influencia o controle do crescimento. Alterações na regulação de CDKN2D têm sido investigadas na biologia do câncer e em outros estados hiperproliferativos para compreender a evasão de checkpoints, o comprometimento de linhagem e a estabilidade do genoma.

p19 INK4D/CDKN2D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDKN2D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p19 INK4D/CDKN2D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDKN2D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDKN2D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p19 INK4D/CDKN2D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDKN2D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p19 INK4D/CDKN2D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p19 INK4D/CDKN2D em células tumorais com expressão de CDKN2D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.