Plásmido CRISPR de Activación (h) Ox40L: sc-403518-ACT

TNFSF4 codifica OX40L (CD252), un ligando de la superfamilia del TNF expresado predominantemente en células presentadoras de antígeno, que se une al receptor OX40 (TNFRSF4) en células T activadas para promover la coestimulación, la proliferación y la supervivencia. La señalización OX40L–OX40 amplifica la actividad de las vías NF-κB, MAPK y PI3K/AKT aguas abajo, moldeando la diferenciación efectora, la formación de memoria y los programas de citocinas en la inmunidad adaptativa. La expresión desregulada de TNFSF4 se ha vinculado a microambientes inmunitarios inflamatorios y a mecanismos de tolerancia alterados, con relevancia para el riesgo genético asociado a autoinmunidad y para la investigación en inmunología tumoral. Como ligando unido a membrana, OX40L también contribuye a la comunicación célula–célula en tejidos linfoides y en sitios inflamados, influyendo en la ayuda a células B y en las respuestas impulsadas por antígeno.

Ox40L El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TNFSF4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ox40L El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TNFSF4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TNFSF4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ox40L. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TNFSF4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ox40L en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ox40L en células tumorales con expresión de TNFSF4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.