Plásmido CRISPR de Activación (m) OTUD2: sc-432624-ACT

El gen Yod1 de ratón codifica la desubiquitinasa OTUD2, una enzima con dominio OTU que edita cadenas de ubiquitina para moldear la estabilidad de las proteínas y la salida de las señales de señalización. La actividad de OTUD2 se asocia con el control dependiente de ubiquitina de vías inflamatorias y de respuesta al estrés, incluida la modulación de la señalización de NF-κB y de la proteostasis bajo estrés del retículo endoplásmico (RE). Al ajustar los estados de ubiquitinación de los componentes de estas vías, Yod1 puede influir en la dinámica de la señalización de la inmunidad innata, la apoptosis y la homeostasis celular. La señalización de ubiquitina y la proteostasis desreguladas están ampliamente implicadas en patologías impulsadas por el sistema inmunitario, la neurodegeneración y la biología del cáncer, lo que convierte a OTUD2 en un nodo útil para estudios mecanísticos de la edición de ubiquitina en contextos relevantes para la enfermedad.

OTUD2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Yod1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

OTUD2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Yod1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Yod1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de OTUD2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Yod1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de OTUD2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía OTUD2 en células tumorales con expresión de Yod1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.