Plásmido CRISPR de Activación (h) ORP-8: sc-405318-ACT

OSBPL8 codifica la proteína 8 relacionada con la proteína fijadora de oxiesteroles (ORP-8), un factor de transferencia de lípidos y detección de esteroles que ayuda a coordinar la distribución celular de colesterol y fosfolípidos en sitios de contacto entre membranas, en particular entre el retículo endoplásmico y otros orgánulos. ORP-8 contribuye a la regulación del metabolismo lipídico, la composición de membranas y procesos de señalización vinculados al manejo de fosfoinosítidos y al tráfico vesicular, modulando la homeostasis celular ante cambios en nutrientes o condiciones de estrés. La actividad alterada de ORP-8 se ha estudiado en contextos de desregulación del manejo de lípidos y de señalización inflamatoria, que con frecuencia se asocian a la biología de enfermedades metabólicas y cardiovasculares, así como a la remodelación metabólica vinculada a tumores. En modelos de células humanas, la modulación de ORP-8 es, por tanto, relevante para desentrañar la comunicación cruzada entre vías impulsadas por lípidos que influye en la proliferación, las respuestas al estrés y la comunicación entre orgánulos.

ORP-8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de OSBPL8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ORP-8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus OSBPL8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional OSBPL8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ORP-8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo OSBPL8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ORP-8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ORP-8 en células tumorales con expresión de OSBPL8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.