Plasmide CRISPR d'Activation (h) Orai3: sc-403426-ACT

ORAI3 code pour Orai3, une sous-unité de canal CRAC (calcium release–activated calcium) de la membrane plasmique, qui contribue à l’entrée de calcium opérée par les stocks (SOCE, *store-operated calcium entry*) après déplétion du Ca2+ du réticulum endoplasmique. En modulant la dynamique du Ca2+ cytosolique, Orai3 influence des programmes de signalisation en aval dépendants du Ca2+, notamment la transcription pilotée par NFAT, la progression du cycle cellulaire et la sécrétion couplée à un stimulus. La fonction d’ORAI3 s’articule avec les protéines STIM et d’autres membres de la famille ORAI afin d’ajuster l’assemblage du canal et la sélectivité ionique, modulant ainsi l’excitabilité cellulaire et les réponses au stress. Une expression dérégulée d’ORAI3 ou un remodelage de la SOCE ont été associés dans la littérature à des altérations de la signalisation proliférative, de la gestion du stress oxydant et à des phénotypes pertinents pour la biologie du cancer et la fonction des cellules immunitaires.

Orai3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ORAI3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Orai3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ORAI3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ORAI3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Orai3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ORAI3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Orai3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Orai3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ORAI3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.