Orai2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403535-ACT

Humanes ORAI2 kodiert Orai2, eine zentrale Untereinheit des Calcium-Release-Activated-Calcium-(CRAC)-Kanals, der nach Erschöpfung der ER-Ca2+-Speicher den speicherabhängigen Calciumeinstrom (store-operated calcium entry, SOCE) vermittelt. Durch die Steuerung des zytosolischen Ca2+-Einstroms justiert Orai2 nachgeschaltete Signalprogramme, darunter die Calcineurin–NFAT-vermittelte Transkription, MAPK-Aktivität und weitere Ca2+-abhängige Signalwege, die Immunaktivierung, Sekretion und allgemein die Kopplung von Reiz und Antwort prägen. Eine veränderte ORAI2-Expression oder ein verschobenes Gleichgewicht der CRAC-Kanalzusammensetzung kann die Schwellenwerte der Calciumsignalgebung verschieben und so zu fehlregulierter inflammatorischer Signalübertragung, aberranter Zellproliferation und kontextabhängigen Stressantworten beitragen. Daher wird ORAI2 häufig in Modellen der Immunzellfunktion, der epithelialen Signalgebung und in Mechanismen untersucht, die Ca2+-Homöostase mit krankheitsrelevanten Phänotypen verknüpfen.

Orai2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ORAI2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Orai2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ORAI2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ORAI2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Orai2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ORAI2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Orai2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Orai2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ORAI2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.