Plásmido CRISPR de Activación (h) Orai1: sc-400901-ACT

ORAI1 codifica Orai1, la subunidad formadora del poro del canal de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) que media la entrada de calcio operada por depósitos (SOCE) tras el agotamiento de Ca²⁺ del retículo endoplásmico. Al permitir un influjo sostenido de Ca²⁺, Orai1 regula programas transcripcionales aguas abajo dependientes de Ca²⁺, como la señalización de NFAT, modulando la activación de linfocitos, la producción de citocinas y, de forma más amplia, las funciones efectoras de las células inmunitarias. La actividad de ORAI1 también influye en la proliferación, la migración y la secreción en múltiples tipos celulares a través de vías sensibles al Ca²⁺ y redes de homeostasis iónica. La desregulación de la señalización ORAI1/SOCE se ha vinculado a fenotipos de disfunción inmunitaria y a la patobiología inflamatoria, lo que respalda su uso como nodo mecanístico en estudios de señalización celular.

Orai1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ORAI1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Orai1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ORAI1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ORAI1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Orai1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ORAI1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Orai1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Orai1 en células tumorales con expresión de ORAI1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.