OPG/Osteoprotegerin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400497-ACT

TNFRSF11B kodiert Osteoprotegerin (OPG), einen sezernierten Köderrezeptor aus der TNF-Rezeptor-Superfamilie, der an RANKL (TNFSF11) bindet und die RANK–RANKL-Signalübertragung begrenzt. Dadurch moduliert er die Differenzierung von Osteoklasten und den Knochenumbau. Durch das Abfangen von RANKL und verwandten Liganden beeinflusst OPG die nachgeschaltete Aktivierung der NF-κB- und MAPK-Signalwege in Osteoklastenvorläufern und trägt zur Kopplung zwischen Osteoblasten- und Osteoklastenaktivität bei. Über die Skelettbiologie hinaus wurde OPG auch mit vaskulären und immunassoziierten Prozessen in Verbindung gebracht, unter anderem durch die Regulation von Zytokinsignalen und Hinweisen aus der extrazellulären Mikroumgebung. Eine dysregulierte Expression von TNFRSF11B/OPG ist mit veränderten Phänotypen des Knochenumsatzes assoziiert und wurde in Kontexten wie Osteoporose, Mechanismen osteolytischer Erkrankungen und kalkifikationsbezogener Pathobiologie untersucht.

OPG/Osteoprotegerin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF11B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OPG/Osteoprotegerin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF11B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF11B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OPG/Osteoprotegerin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF11B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OPG/Osteoprotegerin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OPG/Osteoprotegerin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF11B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.