Plasmide CRISPR d'Activation (h) NYD-SP29: sc-410284-ACT

WDR63 code pour NYD-SP29, une protéine contenant des répétitions WD, dont la fonction prédite est de servir d’échafaudage pour l’assemblage de complexes multiprotéiques via des domaines WD en β-propeller. Les profils d’expression et d’annotation associent NYD-SP29 à des processus dépendants des microtubules et à l’organisation du cytosquelette, avec une pertinence particulière pour les structures du centrosome, du cil et du flagelle dans les cellules humaines. Ces voies soutiennent la polarité cellulaire, le transport intracellulaire et la signalisation ciliaire, et leur perturbation est fréquemment étudiée dans le contexte de défauts du développement et de troubles impliquant des cils motiles. Ainsi, WDR63/NYD-SP29 présente un intérêt pour des études mécanistiques de la ciliogenèse et de la régulation associée aux microtubules.

NYD-SP29 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WDR63 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NYD-SP29 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WDR63 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WDR63, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NYD-SP29. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WDR63 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NYD-SP29 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NYD-SP29 dans les cellules tumorales présentant une expression de WDR63 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.