Plásmido CRISPR de Activación (h) NPRL2: sc-402875-ACT

El NPRL2 humano codifica un componente central del complejo GATOR1, un regulador negativo clave de la señalización de mTORC1 que conecta la disponibilidad de aminoácidos con el control del crecimiento celular. Al favorecer la restricción de la actividad de mTORC1, NPRL2 contribuye a las respuestas al estrés por nutrientes, a la regulación de la autofagia y a la homeostasis metabólica, influyendo en la síntesis de proteínas y la progresión del ciclo celular. La alteración de la expresión o función de NPRL2 se ha asociado con una actividad desregulada de la vía de mTOR observada en diversos contextos de proliferación aberrante y adaptación al estrés, lo que lo hace relevante para estudios mecanísticos del control del crecimiento. NPRL2 también se utiliza como un nodo para investigar los circuitos de detección de nutrientes y los programas transcripcionales posteriores que moldean la supervivencia celular y la capacidad biosintética.

NPRL2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NPRL2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NPRL2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NPRL2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NPRL2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NPRL2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NPRL2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NPRL2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NPRL2 en células tumorales con expresión de NPRL2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.