Plásmido CRISPR de Activación (h) Npl4: sc-403787-ACT

El gen humano **NPLOC4** codifica Npl4, un cofactor central de la ATPasa p97/VCP que actúa junto con UFD1 para reconocer y extraer sustratos ubiquitinados y permitir su procesamiento por el proteasoma. A través de sus dominios de unión a ubiquitina, Npl4 ayuda a coordinar la degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD), la eliminación de cadenas nacientes asociadas a ribosomas detenidos y un control más amplio de la proteostasis que influye en la progresión del ciclo celular y en la señalización adaptativa al estrés. Estas vías convergen con las respuestas al daño del ADN y con programas transcripcionales inflamatorios al regular el recambio de proteínas clave de señalización y asociadas a la cromatina. La desregulación del eje VCP–UFD1–NPL4 se asocia con estrés proteotóxico, alteración de la homeostasis proteica y vulnerabilidad en estados proliferativos, lo que convierte a NPLOC4 en un objetivo relevante para estudios mecanísticos en neurodegeneración y biología del cáncer.

Npl4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NPLOC4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Npl4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NPLOC4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NPLOC4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Npl4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NPLOC4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Npl4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Npl4 en células tumorales con expresión de NPLOC4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.