NOXA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400498-ACT

PMAIP1 kodiert NOXA, ein ausschließlich BH3-domäniges, proapoptotisches Mitglied der BCL2-Familie, das die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran fördert, indem es bevorzugt MCL1 und verwandte antiapoptotische Proteine antagonisiert. NOXA wird durch zelluläre Stresssignale rasch induziert, darunter p53-abhängige DNA-Schadensantworten, und verknüpft Apoptose mit Proteostase sowie hypoxieassoziierter Signalübertragung. Durch die Verschiebung des Gleichgewichts der Interaktionen innerhalb der BCL2-Familie beeinflusst NOXA die Caspase-Aktivierung, die Integrität der Mitochondrien und Entscheidungen über das Zellschicksal. Eine dysregulierte PMAIP1/NOXA-Expression wurde mit einer veränderten apoptotischen „Priming“-Bereitschaft in der Krebsbiologie sowie mit Stressantwort-Phänotypen in Verbindung gebracht, die für neurodegenerative und entzündliche Kontexte relevant sind.

NOXA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PMAIP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NOXA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PMAIP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PMAIP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NOXA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PMAIP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NOXA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NOXA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PMAIP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.