NNMT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403192-ACT

NNMT (nicotinamide N-metiltransferasi) umano è una metiltransferasi citosolica che catalizza la N-metilazione della nicotinamide e di piridine correlate utilizzando la S-adenosil-L-metionina, collegando il metabolismo degli xenobiotici all’omeostasi dei donatori di metili. Influenzando l’equilibrio SAM/SAH e il flusso metabolico legato a nicotinamide/NAD⁺, NNMT può modulare la capacità di metilazione epigenetica e lo stato metabolico più generale. Un’espressione alterata di NNMT è stata associata a riprogrammazione metabolica e a cambiamenti nella differenziazione cellulare e nelle risposte allo stress in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studiare l’accoppiamento tra metabolismo ed epigenoma. NNMT è quindi spesso studiato in vie correlate al metabolismo a un carbonio, alla regolazione redox e al controllo trascrizionale.

NNMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NNMT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NNMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NNMT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NNMT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NNMT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NNMT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NNMT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NNMT nelle cellule tumorali con espressione di NNMT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.