Nkx-6.2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403584-ACT

NKX6-2 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Nkx-6.2, einen sequenzspezifischen, DNA-bindenden Regulator, der die Festlegung von Zelllinien sowie Reifungsprogramme im sich entwickelnden zentralen Nervensystem mitsteuert. Die Aktivität von Nkx-6.2 ist in neuronale Musterbildungs- und Differenzierungsnetzwerke eingebunden, indem sie Transkriptionskaskaden moduliert, die Zellschicksalsentscheidungen und die nachgeschaltete Genexpression prägen. In der Humanbiologie ist eine veränderte Regulation von NKX6-2 für Studien zu neuroentwicklungsbezogenen Prozessen und myelinisierungsassoziierten Genprogrammen relevant, bei denen eine fehlerhafte transkriptionelle Verschaltung neuronale und gliale Reifungszustände stören kann. Als nukleärer Transkriptionsregulator wird Nkx-6.2 häufig in der Pathway-Kartierung, der Analyse entwicklungsabhängiger Zeitabläufe und der Untersuchung regulatorischer Netzwerke erforscht, die Promotor-/Enhancer-Besetzung mit Phänotypen verknüpfen.

Nkx-6.2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NKX6-2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nkx-6.2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NKX6-2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NKX6-2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nkx-6.2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NKX6-2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nkx-6.2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nkx-6.2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NKX6-2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.