Plasmide CRISPR d'Activation (h) NK-2R: sc-403149-ACT

TACR2 code le récepteur de la neurokinine 2 (NK-2R), un RCPG de classe A qui se lie préférentiellement aux tachykinines, telles que la neurokinine A, afin de réguler la contractilité du muscle lisse et les réponses sécrétoires. Après liaison du ligand, NK-2R signale principalement via Gq/11 pour activer la phospholipase C, induire la production d’IP3/DAG, mobiliser le Ca2+ intracellulaire et engager des programmes transcriptionnels dépendants de la PKC. L’activité de TACR2 croise la signalisation MAPK/ERK et, plus largement, la communication médiée par les neuropeptides qui module le tonus inflammatoire et l’excitabilité tissulaire. Une signalisation TACR2/NK-2R dérégulée a été impliquée dans des mécanismes liés à l’hyperréactivité des voies aériennes et du tractus gastro-intestinal, à l’inflammation neurogène et à l’altération du traitement nociceptif.

NK-2R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TACR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NK-2R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TACR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TACR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NK-2R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TACR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NK-2R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NK-2R dans les cellules tumorales présentant une expression de TACR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.