Plasmide CRISPR d'Activation (m) NIPBL: sc-427895-ACT

Le gène murin *Nipbl* code NIPBL, un facteur de chargement des cohésines qui positionne le complexe cohésine sur la chromatine afin d’assurer la cohésion des chromatides sœurs, la réplication de l’ADN et la ségrégation des chromosomes. Au-delà de la mitose, NIPBL contribue à l’organisation de l’architecture génomique de haut niveau et régule des programmes transcriptionnels du développement en influençant la communication entre enhancers et promoteurs. Par ces fonctions, il affecte des voies liées à la stabilité du génome et aux décisions de destinée cellulaire, notamment les réponses au stress de réplication et la réparation des cassures double brin. Une dérégulation de la fonction de NIPBL est associée à des phénotypes liés aux cohésinopathies et a été utilisée pour modéliser, in vivo et dans des systèmes cellulaires, les mécanismes à l’origine d’anomalies neurodéveloppementales et de croissance.

NIPBL Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nipbl sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NIPBL Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nipbl dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nipbl, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NIPBL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nipbl natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NIPBL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NIPBL dans les cellules tumorales présentant une expression de Nipbl silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.