NFS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403102-ACT

Das humane NFS1 kodiert eine Cystein-Desulfurase, die Schwefel aus L‑Cystein mobilisiert, um die Biogenese von Eisen‑Schwefel‑(Fe‑S-)Clustern in Mitochondrien zu unterstützen, wobei sie mit Partnerproteinen im Kernkomplex der Assemblierungsmaschinerie zusammenwirkt. Indem NFS1 die Reifung Fe‑S‑abhängiger Enzyme ermöglicht, beeinflusst es die oxidative Phosphorylierung, den lipoinsäureabhängigen mitochondrialen Stoffwechsel und die Redoxhomöostase, mit nachgeschalteten Effekten auf DNA‑Replikation/-Reparatur und zelluläre Stressantworten. Eine Störung der Fe‑S‑Cluster-Assemblierung kann die Funktion der Atmungskette und die Aktivität metabolischer Enzyme beeinträchtigen und verknüpft so NFS1‑regulierte Signalwege mit mitochondrialer Dysfunktion und Phänotypen der Genomstabilität, die in unterschiedlichen krankheitsrelevanten Kontexten untersucht werden. Als zentraler Knotenpunkt der mitochondrialen Kofaktor-Biosynthese wird NFS1 häufig in Modellen metabolischer Verwundbarkeit, oxidativen Stresses und veränderter Proliferationszustände untersucht.

NFS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NFS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NFS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NFS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NFS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NFS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NFS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NFS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NFS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NFS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.