neutral ceramidase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404967-ACT

ASAH2 umano codifica la ceramidasi neutra, un’amidasi associata alla membrana che idrolizza la ceramide in sfingosina e acidi grassi liberi, contribuendo a mantenere l’omeostasi degli sfingolipidi e la segnalazione mediata da lipidi bioattivi. Controllando l’equilibrio ceramide–sfingosina, ASAH2 influenza la produzione a valle di sfingosina-1-fosfato e si interseca con vie che regolano la composizione dei microdomini di membrana, l’apoptosi, l’autofagia e la segnalazione infiammatoria. L’attività di ASAH2 è stata collegata al metabolismo lipidico intestinale ed epiteliale ed è spesso studiata nel contesto dell’adattamento delle cellule tumorali allo stress, del rimodellamento metabolico e della biologia dell’infiammazione mucosale. Queste funzioni rendono ASAH2 un nodo utile per analizzare le reti di segnalazione guidate dalla ceramide e la regolazione del destino cellulare mediata dai lipidi.

neutral ceramidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ASAH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

neutral ceramidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ASAH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ASAH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di neutral ceramidase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ASAH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da neutral ceramidase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via neutral ceramidase nelle cellule tumorali con espressione di ASAH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.