neutral ceramidase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404967-ACT

Humanes ASAH2 kodiert die neutrale Ceramidase, eine membranassoziierte Amidase, die Ceramid zu Sphingosin und freien Fettsäuren hydrolysiert und damit die Sphingolipid-Homöostase sowie die Signalgebung bioaktiver Lipide prägt. Durch die Kontrolle des Ceramid–Sphingosin-Gleichgewichts beeinflusst ASAH2 die nachgeschaltete Bildung von Sphingosin-1-phosphat und greift in Signalwege ein, die die Zusammensetzung von Membran-Mikrodomänen, Apoptose, Autophagie und inflammatorische Signalübertragung regulieren. Die ASAH2-Aktivität wurde mit dem intestinalen und epithelialen Lipidstoffwechsel in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Stressadaptation von Krebszellen, metabolischer Umprogrammierung und der Biologie mukosaler Entzündungen untersucht. Diese Funktionen machen ASAH2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Erforschung ceramidgetriebener Signalnetzwerke und der lipidvermittelten Regulation des Zellschicksals.

neutral ceramidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASAH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

neutral ceramidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASAH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASAH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen neutral ceramidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASAH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von neutral ceramidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des neutral ceramidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASAH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.