Plasmide CRISPR d'Activation (h) Neurofibromin: sc-400625-ACT

NF1 code la neurofibromine, un grand suppresseur de tumeur cytoplasmique qui agit principalement comme protéine activatrice de la GTPase Ras (Ras-GAP), en accélérant la conversion de Ras-GTP actif en Ras-GDP inactif. Par cette régulation négative, la neurofibromine module les voies MAPK/ERK et PI3K–AKT, influençant la prolifération, la différenciation et les réponses au stress dans de multiples types cellulaires. NF1 interagit également avec la signalisation cAMP/PKA et des programmes du cytosquelette qui affectent la migration cellulaire et la biologie des neurites. Les altérations avec perte de fonction de NF1 sont associées à une dérégulation de l’activité de la voie Ras et font l’objet de nombreuses études dans des contextes neurodéveloppementaux et liés au cancer, faisant de NF1 un nœud central pour la recherche mécanistique sur les voies de signalisation.

Neurofibromin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Neurofibromin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Neurofibromin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Neurofibromin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Neurofibromin dans les cellules tumorales présentant une expression de NF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.